DNA酶

取自 食品百科全书

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Skaggs 化学生物学院的 Gerald F. Joyce 教授领导的研究组,利用体外演化的方法将RNA 酶转化成了DNA酶,这将有助于了解有关生命的一个最基本问题,即生命如何由RNA世界演化为今天的以DNA和蛋白质为基础的细胞形式。   新研究显示RNA酶要转化成具有同等功能的为 DNA酶,仅仅需要少数几个关键变异的演化步骤。   地球早期生命的基因信息与催化功能都是依靠RNA来完成。这项研究也揭示出这种RNA 转变为 DNA 过程的演化路径可能也存在于其它与核酸相似的物质中。因此,这项研究的新发现将有助于了解生命基础结构以及其如何演化。   许多可能是原始前RNA的分子都具有能与自身和 RNA 形成碱基配对结构的能力。新的研究则显示,RNA酶演化改变为具相同催化功能的DNA酶(deoxyribozyme)可能是通过随机变异和选择而产生的。   这项研究以体外演化方式将RNA 核酸酶转化成相对应的脱氧核糖核酸。Ribozyme 首先利用与 RNA 相同序列、但不具催化活性的DNA 分子组成。在加入大量含随机变异的DNA 分子并进行体外演化后,DNA酶获得与最初 ribozyme 相同的酶活性。   这种体外演化方式能提供快速将ribozyme 转化为相对应DNA核醣酶体。该研究通过在实验室内进行多个世代的演化获得的信息还将可能用于治疗与诊断等领域

DNA连接酶

1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外),而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。 一般性质:大肠杆菌的DNA连接酶是一条分子量为75KD的多肽链。对胰蛋白酶敏感,可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性,可以催化酶与NAD(而不是ATP)反应形成酶-AMP中间物,但不能继续将AMP转移到DNA上促进磷酸二酯键的形成。DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子,和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近,这也是比较合理的现象。因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合,填满双链DNA上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用,连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。 噬菌体T4DNA连接酶分子也是一条多肽链,分子量为60KD,其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化过程需要ATP辅助。T4DNA连接酶可连接DNA-DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和双链DNA粘性末端或平头末端。另外,NH4C1可以提高在大肠杆菌DNA连接酶的的催化速率,而对T4DNA连接酶则无效。无论是T4DNA连接酶,还是大肠杆菌DNA连接酶都不能催化两条游离的DNA链相连接。

DNA限制性内切酶酶切

DNA的限制性内切酶酶切分析   限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。   5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3'   3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'   DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。大部分限制性内切酶不受RNA或单链DNA的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后,用等体积酚/氯仿抽提,加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙醇,混匀后置-70℃低温冰箱30分钟,离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。   DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理图谱,它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成,以直线或环状图式表示。在DNA序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中,建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节,近年来发展起来的RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。   构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。通常结合使用多种限制性内切酶,通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。   在酶切图谱制作过程中,为了获得条带清晰的电泳图谱,一般DNA用量约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反应最适条件各不相同,各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量,一般增加2-3倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。

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