酶标免疫分析定量测定黄曲霉毒素B1试剂盒使用方法
取自 食品百科全书
简介
采用竞争酶标免疫法定量测定谷物，饲料及其它食品中的黄曲霉毒素B1。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。
目录 |
[编辑] 1. 用途
Aflatoxin B1采用竞争酶标免疫法定量测定谷物及饲料中的黄曲霉毒素B1。
[编辑] 2. 概要
黄曲霉毒素是主要由黄曲霉 (aspergillus flavus) 寄生曲霉 (a.parasiticus) 产生的次生代谢产物，在湿热地区食品和饲料中出现黄曲霉毒素的机率最高。B1是最危险的致癌物，经常在玉米，花生，棉花种子，一些干果中常能检测到。根据毒力的的大小，EU制订了黄曲霉毒素的限量标准，黄曲霉毒素B1限量2ppb，黄曲霉毒素总量限量4ppb。RIDASCREEN Aflatoxin B1检测试剂盒则能够提供快速而准确的分析。
[编辑] 3. 测定原理
测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有黄曲霉毒素B1的特异抗体。加入标准或样品溶液及黄曲霉毒素B1酶标记物和抗体，游离黄曲霉毒素与黄曲霉毒素酶标记物竞争黄曲霉毒素抗体，同时黄曲霉毒素抗体与羊抗体连接。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。将基质/发色剂加入到孔中并且孵育。结合的酶标记物将红色的基质/发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝转变为黄色。在450nm处（参比波长大于600nm）测量，吸收光强度与样品中的浓度成反比。
[编辑] 4. 提供的试剂
每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔），盒中的材料如下：
1 X 96孔板（12条 X 8孔）包被有抗兔IgG的羊抗体
6 X 黄曲霉毒素B1标准液，1.3 ml/瓶，标准液浓度为：0ppb， 1ppb，5ppb，10ppb，20ppb，50ppb
1 X 酶标记的黄曲霉毒素B1溶液（6ml）……………….红色帽
1 X 黄曲霉毒素B1抗体溶液（6ml）…………………....黑色帽
1 X 基质/发色剂（10ml）………………………………….蓝色帽
1 X 反应停止液（14ml）1N硫酸...….………………………黄色帽
1 X 洗涤缓冲液：10mM的磷酸盐缓冲液PH 7.4 包含 0.05% 的吐温-20
注意：由于样品的稀释倍数是10，因此样品中黄曲霉毒素的浓度可以直接从标准曲线上读出。
[编辑] 5. 需要的材料但盒中不提供
5.1设备
---微孔板酶标仪（450nm）定量分析用
---量筒（塑料或玻璃）100ml
---样品提取的玻璃制品：漏斗和50ml的长颈瓶
---粉碎机
---振荡器
---滤纸
---刻度移液管
---50µl，100µl及1000µl和微量加样器
5.2 试剂
---甲醇
---蒸馏水或去离子水
70%甲醇溶液的配制
---取70ml的100%的甲醇
---加入30ml的去离子水或者蒸馏水，振荡充分混匀
[编辑] 6. 操作者应该注意之事项
---标准液含有黄曲霉毒素B1，应特别小心
---使用过的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜
---反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤
---不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起 灵敏度的降低
---不要交换使用不同批号的盒中试剂
[编辑] 7. 储存条件
---保存试剂盒于2-8℃。不要冷冻
---将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封
---标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下
---基质/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下
[编辑] 8. 试剂变质的迹象
红色的基质/发色剂有任何蓝色表明基质/发色剂变质，应当弃之。
0标准的吸光度值小于0.6个单位 (A450nm<0.6)时，表示试剂可能变质。
[编辑] 9. 样品处理
样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存
---代表性的样品粉碎后，彻底混均
---称取5g 粉碎后样品于带盖玻璃瓶中，加入25ml 70%的甲醇
---振荡3分钟
---Whatman No. 1滤纸（或相当滤纸）过滤全部样品溶液
---1ml滤液与1ml 蒸馏水混合于螺口盖的离心瓶
---取50ul样品提取液进行分析
注意：如果样品中黄曲酶毒素的浓度比预计的浓度高，样品必须进一步稀释。用35%甲醇（35ml甲醇+65ml水）进一步稀释。
[编辑] 10. 酶标免疫分析程序
10.1测定之前注意事项
1. 用之前将所有试剂回升至室温（20-25℃）。
2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3. 在使用中不要让微孔干燥。
4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。
5. 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。
10.2包被有抗体的微孔板条
锡箔袋沿横向压皱外边打开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻。
10.3标准液
由于样品的稀释倍数是10，因此样品中黄曲霉毒素的浓度可以直接从标准曲线上读出。
10.4洗涤缓冲液
试剂盒中提供洗涤缓冲液干粉，用1L的蒸馏水溶解，在4℃下准备好的洗涤缓冲液能保存4周。
用100mL的蒸馏水溶解1包洗涤缓冲液干粉，可以得到10X的洗涤缓冲液，在室温（20-25℃）下10X的洗涤缓冲液可以保存8周。取1份10X的洗涤缓冲液，取9份的蒸馏水混合，可配制成直接使用的洗涤缓冲液。
10.5测定程序 （在20-24℃条件下操作）
1. 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。
2. 加入50ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头。
3. 加入50ul稀释了的酶标记物（红色盖）到微孔底部。
4. 加入50ul抗体溶液（黑色盖）到每一个微孔底部，小心地使酶标板在平面上做圆周运动以充分混合。在室温下（20℃-25℃）孵育30分钟。
5. 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250ul洗涤缓冲液加入孔中。再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，再重复操作洗涤步骤两次以上。
6. 加入 100ul基质/发色剂（蓝色盖）到微孔中，充分混合并在室温（20℃-25℃）暗处孵育15分钟。
7. 加入100ul反应停止液（黄色盖）到微孔中充分混合。混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，必须在加入停止液后15分钟内读取光度值。
[编辑] 11. 结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。
标准的吸光度值（或样品）
x 100= %吸光度值
0标准的吸光度值
计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素B1浓度（ng/kg）的半对数坐标系统曲线图，相对应每一个样品的浓度（ng/kg）可以从标准曲线上读出。
（曲线省略）
请注意
为了获得样品中的黄曲霉毒素B1的实际浓度（ng/kg），从标准曲线上读出的浓度值。
[编辑] 12. 灵敏度
黄曲酶毒素试剂盒的平均检测下限为1ppb （1µg/kg）。
[编辑] 13. 特异性
RIDASCREEN黄曲霉毒素B1试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到
