菌株

取自 食品百科全书

菌株（microbial strain）

菌株即微生物品系。任何由一个独立分离的微生物单细胞(或单个病毒粒子)繁殖而成的纯种群体及其一切后代。一种微生物的每一不同来源的纯培养物均是该菌种的一个菌株。同一菌株中的每一个体都具遗传纯的克隆关系。菌株名称以符号和(或)编号表示，写在学名后。如Bifidobacterium difidum ATCC 29 521即表示是两叉双歧杆菌的“ATCC 29 521菌株”。

因此,一种微生物的每一个不同来源的纯培养物均可称为该菌种的一个菌株。根据菌株的定义,菌株实际上是某一微生物达到“遗传性纯”的标志,一旦菌株发生变异,均应标上新的菌株名称。当进行菌种保藏、筛选或科学研究时,在进行学术交流或发表论文时,在利用菌种进行生产时,都必须同时标明该菌种及菌株名称。 如标准菌株 type culture strain ，亦称模式菌株。在给某细菌定名，分类作记载和发表时，为了使定名准确和作为分类概念的准则，以纯粹活菌（可繁殖）状态所保存的菌种。相当于动植物分类中的模式标本。在进行细菌等的分类和鉴定时，生理学和生物化学特性十分重要，但若就这些性质进行试验，就必须应用许多纯分离的新细胞。因此，作为分类标准的菌种，也有必要进行纯粹分离，并以活菌（可以分裂）状态保存。在标准菌种中，对于从作过原始记载的作者实际分离或应用的菌株，通过营养繁殖获得和保存的菌株，称为正标准菌株。此外，当原作者使用复数菌株，以后的研究者选择其中之一作为最适当的菌株时，称该菌种为选定标准菌株。当原作者使用的菌株失掉，以后的研究者就新的菌株研究，记载后，确认可以作为国际上正标准菌株的代替菌株时，称该菌株为新模式菌株。保存菌种时，必须留心不使菌株在保存过程中死亡或发生变异。目前最常用的保存方法是冻结干燥法。模式菌株应由适当的菌种保存机构保存。 念珠菌病 candidiasis 　　一种条件致病菌感染，由白念珠菌和(或)其他含珠菌引起的皮肤、粘膜或内脏的疾病。可以感染胎儿、新生儿、儿童直至老人,可侵犯不同的组织和脏器,又可引起各种过敏性反应。既可感染浅表，也可感染深部。由于抗生素的使用引起菌群失调、内外源的免疫力低下及创伤性的诊疗措施使条件致病菌，首先是念珠菌感染成倍增加。不少病人因延误诊治，最终导致死亡。若早期发现和用有效药物治疗，多可治愈。 病原,念珠菌属于酵母,其中白念珠菌最为常见,致病力也最强。念珠菌广泛存在于自然界，尤其是水、蔬菜、水果、奶制品中。在正常情况下，白念珠菌在健康人的口腔、肠道、阴道等处都有存在，并不致病，只有在抵抗力下降时才引起感染。因此，此菌为条件致病真菌。 良好的菌种是微生物发酵工业的基础。在应用微生物生产各类食品时，首先是选种的问题，要挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索取；另一方面根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三当菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。 自然界工业菌种筛选程序 我国幅员辽阔，各地气候条件、土质条件、植被条件差异很大，这为自然界中各种微生物的存在提供了良好的生存环境。自然界中微生物种类繁多，估计不少于几十万种，但目前已为人类研究及应用的不过千余种。由于微生物到处都有，无孔不入，所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。而现代发酵工业是以纯种培养为基础，故采用各种不同的筛选手段，挑选出性能良好、符合生产需要的纯种是工业育种的关键一步。自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是：采样、增殖培养、培养分离和筛选。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。 采样 以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中，雨量不多的秋初为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等，采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和腐质，根系及根系周围区域，海底水，泥及沉积物，植物表皮及各部，阴沟污水及污泥，反色动物第一胃内含物，发酵食品等。

具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存试样会使嗜冷菌数量明显降低。

在采集植物根际土样时，一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出，浸渍在大量无菌水中约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。

在采集水样时，将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30~50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。

增殖培养

一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率。可以通过选择性的配制培养基（如营养成分、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或淘汰。对G一菌有选择的培养基(如结晶紫营养培养基、红—紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时，培养基中添加浓度一般为50μg／m1的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常于培养基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁) 作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌类型；放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物(如几丁质)，因此，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的；在放线菌分离琼脂中通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，为了对某些特殊种类的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分离真菌时，利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和签定；在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成；抑制细菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，将平皿先干燥3~4天；降低培养基的pH值或在无法降低pH时，加入1：30000玫瑰红。这样有利于下阶段的纯种分离。

培养分离

通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且要控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离，常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离。划线分离法要首先倒培养基平板，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线。划线方法可用分步划线法或一次划线法，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。

对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时，由于其菌丝的蔓延性，极易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于单菌落的分离。 筛选 经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌株。

毒性试验

自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。

微生物的诱变育种

从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。以微生物的自然变异为基础的生产选种的几率并不高，因为这种变异率太小，仅为10—6~10—10。为了加大其变异率，采用物理和化学因素促进其诱发突变，这种以诱发突变为基础的育种就是诱变育种，它是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 诱变育种具有极其重要的意义，当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种方法上，杂交、转化、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地发展，但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。

菌株的选择 用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。 另外，对于基因重组的出发菌株，无论是供体还是受体，都必须考虑与重组方式对应的基本性能，如感受态、性亲和性、噬菌体吸附位点等，还必须考虑标记互补、选择性性状、受菌体的强代谢活性、营养需求、生长速度等，以及与社会公害有关的问题如耐药性、致病性、肠道寄生性等。