体细胞胚

取自 食品百科全书

胚由受精卵发育而来，这在生物学中是大家所熟知的，但实际上胚不一定从受精卵发育来，尤其在植物界，往往可以看到未受精的卵细胞或胚囊细胞、珠心细胞等发育成胚的现象。严格地说，除卵以外的胚囊细胞和珠心细胞等都应属于体细胞的范畴，由体细胞发育成的胚就叫做体细胞胚。可见体细胞胚在自然界中早已存在，不过用人工培养的方法诱导营养器官产生胚，却是在二十多年前首次出现的新事物。1958年德国的Reinert在固体培养基上培养胡萝卜的根，发现愈伤组织中有些细胞可以发育成胚。同年，美国Steward等人用悬浮培养的方法，培养胡萝卜的块根细胞，也得到同样的体细胞胚。

他们的工作，引起了世界各国的广泛注意，因为从理论上看，体细胞胚的发生向发育生理学提出了新问题，同时它有力地证明了体细胞同生殖细胞一样也具有遗传上的全能性。从实践上看，体细胞胚的诱导成功，为现代化的非常规育种方法提供了理论基础，人们已可以设想将植物体分离成各个单细胞(例如现在的原生质体培养)，然后采用类似微生物中诱导突变及筛选突变的方法，从分离的体细胞中获得新的优良变异，再通过诱导体细胞胚的途径，使生成完整的植株，来培养新的品种，这种方法将是植物育种工作中的一次革命。

据Wetherell1978年的报道，已有 80种植物能诱导产生体细胞胚，这80种植物分属于33个不同的科，不过据作者最近所得的情报，有些粮食作物，如高粱、谷子也已获得体细胞胚，因此可以认为体细胞胚胎发生在植物界中是一种广泛存在的现象。

一、体细胞胚的类型

上面已说过体细胞胚是一种非合子胚，根据其来源的不同可分成四种类型：

(1)从植物体中营养器官的细胞发育成的胚，如胡萝卜根及咖啡叶经愈伤组织发育成的胚。

(2)从成年植株的珠心细胞及未成熟或已成熟的胚细胞等所发生的体细胞胚，如茄子和苣买菜的胚细胞，甜橙和四季桔(Citrus microcarpa)的珠心细胞经愈伤组织所发生的胚。

(3)胚囊中的细胞及花粉粒，常常也可以发生胚，这种胚应该是单倍体。严格地说，胚囊中的细胞除卵细胞以外，应属于配子体细胞。由花粉粒培养所发生的胚，有人认为是未经分裂的花粉粒反复分裂成愈伤组织后所产生，也有人认为是花粉粒分裂后，所产生的营养核经愈伤组织阶段后发生的，后者很明显也应属于体细胞胚。

(4)上面三种体细胞胚，都需要经过愈伤组织阶段，而有的体细胞胚可从幼株的下胚轴或子叶上直接产生，如在白菜、曼陀罗、毛茛和高粱中可以见到。

二、诱导体细胞胚胎发生的一般程序

诱导体细胞胚胎发生的程序，因植物种类和取材部位的不同而异，但一般可分为以下几个步骤：

1．取植物的一部分组织(如根、茎、叶的切段或胚等)，用组织培养的方法，加以人工培养使其分化，于是细胞就反复分裂产生愈伤组织，这个阶段一般采用固体培养方法比液体培养方法好，通常所采用的脱分化试剂是2,4-D，也有采用与2,4-D相类似的生长素药剂(由于2,4-D容易诱发生物包括人体细胞的突变，用时宜谨慎)。有的植物除2,4-D以外，还需要附加少量的细胞分裂素，至于2,4-D的浓度，则因植物而异，一般宜采用较高的浓度。外植体的年龄也很重要，一般幼龄的较容易产生愈伤组织。

2．用所得的愈伤组织进行悬浮培养，使细胞分散。

3．将悬浮培养物倒在没有植物激素的固体平面培养基上，再进行固体培养，其中有些胚性细胞就有可能发生体细胞胚。

三、诱导体细胞胚发生的基本条件

1．生长素

Halperin与Wetherell(1964)首先认为生长素是诱导体细胞胚胎发生的主要控制因子，所用生长素的种类，因植物种类而异。从大多数的报道看，一般都采用2，4-D，但也有例外，如 Jelaska(1974)在南瓜体细胞胚的诱导中，采用NAA与IBA(吲哚丁酸)，效果显著好于2，4-D。Mullins等(1976)在葡萄中所用的激素是β-萘氧乙酸(β-NOA浓度为 5—25μM)及苄基腺嘌呤(BAP浓度为5—10μM)。Hidmichi．M．等(1979)在茄子下胚轴中用的是NAA，浓度为 8.0mg/l。

有人研究体细胞胚胎发生中不同阶段与生长素之间的关系，认为在诱发产生胚性细胞时，需要高浓度的生长素，当胚性细胞经球形胚、心形胚、鱼雷形胚等不同阶段发育成为成熟胚的过程中，所要求的生长素浓度要低，而成熟胚在发育成植株时则完全不需要生长素。从胚性细胞到植株这一发育过程中，生长素浓度过高，反而会抑制体细胞胚的发育或产生畸形胚。

最近国外在柑桔、白菜和胡萝卜的组织培养中发现一些愈伤组织，不需要任何外源激素就能继代培养，并发生体细胞胚。我国在甘蔗、葡萄等植物中，也发现过类似的情况，这种组织叫做驯化组织。驯化组织很可能是在培养过程中发生的一种突变细胞，它们在激素方面具有自养的能力，也就是说驯化组织的细胞能合成本身所需要的内源激素。

2．还原氮

多数研究者认为供应愈伤组织以充足的还原氮是体细胞胚胎发生的第二个基本条件。Halperin(1966)首先认为体细胞胚胎发生需要还原氮。Wetherell与Dougall(1976)根据他们的研究证实了Halperin的看法，他们以浓度为5—55mM的硝酸盐作唯一氮源时，每培养物平均只发生一个胚，当培养基中加入0.1mM的氯化铵时就能促进胚的形成，如用40 mM硝酸钾及30mM氯化铵这一配比，对愈伤组织的生长及胚胎发生都比较合适。他们还认为谷氨胱胺与丙氨酸能作为胚胎发生与生长的唯一氮源。最近 Dougall与 Verma(1978)证明，如果能在培养过程中控制pH，使其保持在5.4左右，那么野生胡萝卜的悬浮培养能以氨作为唯一氮源。

显然，许多植物在体细胞胚生成过程中都需要还原氮，但也有例外，如芹菜就不需要还原氮。

3．其它因子

通常认为细胞分裂素是体细胞胚胎发生的抑制剂，然而已有实例证明，这种意见至少并不具有普遍意义。在某些实例中，细胞分裂素甚至对体细胞胚胎发生能起促进作用，而且不同的细胞分裂素其作用也不尽相同，例如低浓度的玉米素，能刺激胡萝卜悬浮培养液中的胚胎发生，但相应浓度的激动素或BAP却抑制此过程，而在芹菜中，情况恰好相反，低浓度的激动素能促进其胚胎发生。

一般认为高浓度的钾，能促进愈伤组织的组织化程度，因此常有利于胚胎发生。

另外，steward等人还认为在自然情况下，合子胚一般在子房内发育，其环境是黑暗，而且空气不太流通，因此给于这样条件也有利于体细胞胚的发生与发育。

四、体细胞胚的成熟

一般说来体细胞胚一旦发生，不需要进一步处理，在无任何外源激素的条件下就能自行成熟。培养基中若有生长素残留反而会使胚发育异常，但也有些植物却要求在培养基中具有一定的外源激素，例如葡萄体细胞胚的成熟就需要浓度为1μM的GA3 和5μM的2ip(异戊烯基腺嘌呤)。

有人认为蔗糖浓度对胚的发生和成熟也有很大影响，在诱导体细胞胚发生时需要高浓度的糖，但在体细胞胚成熟时却需要相应地降低糖的浓度。 Neuman与 de Garcia(1974)认为培养基中糖的浓度超过2％时就不利于胚的成熟。

此外，用6℃左右的低温处理，常常对有些植物体细胞胚的成熟有利。

五、体细胞胚胎发生的生化

关于体细胞胚胎发生的生化过程研究很少，而体细胞胚发生的本质却需要详细研究生化过程才能加以揭露。从事生化研究的困难在于必须使体细胞胚在培养过程中能大量发生，而且又要使同一培养物中体细胞胚的发育过程能尽量同步，这两个先决条件，目前已开始在胡萝卜的培养中设法做到，所以现在已有人利用胡萝卜为材料，研究体细胞胚胎发生过程中蛋白质、RNA与DNA的变化。最近Sung等(1980)将胡萝卜未发生体细胞胚的愈伤组织和已发生胚的愈伤组织作了比较，发现有二种特殊的胚性蛋白质决定体细胞胚的发育过程，这两种蛋白质的作用机理究竟是什么？还有待深入研究。