微生物防腐剂Nisin的研究与应用

取自 食品百科全书

早在1928年，美国L．A．Rogers等首次报道发现乳酸链球菌的代谢产物能抑制保加利亚乳杆菌后，许多科学家对其进行研究。1947年英国的MattickA．T．R认识到血清学N群中的一些乳酸链球菌（Streptococcuslactis）产生具有蛋白质抑制物，并将其命名为“Nisin”；1969年Nisin的第一批商品在英国面市；1969年FAO／WHO食品添加剂联合专家委员会批准Nisin作为食品添加剂使用；1990年3月29日我国卫生部将其列入GB2760－86的1990年增补品种中，可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品。目前已有50多个国家和地区批准Nisin可以作为一种纯天然食品防腐剂使用。

Nisin的特性　 1970年Gross和Morell已阐明Nisin分子的完整结构。Nisin是一种新型低聚肽，随着研究的深入，Nisin的类型由最初（1952年）Bavin等人发现的2种类型，增至到现在的6种类型，分别为A、B、C、D、E和Z，其中对NisinA和NisinZ两种类型的研究最活跃，两者仅在27位氨基酸残基有差别，其抗菌特性几乎无差别。Nisin一级结构由34个氨基酸组成，分子末端有氨基和羧基，还有5个硫桥构成内环，其分子式是C143H228N42O37S7，平均分子量为3510。Nisin活性分子常为二聚体和四聚体，分子量分别为7000和14000。

理化性质

Nisin是一种白色易流动粉末，使用时需溶于水或液体中，不同pH下溶解度也不同。如在一般水中（pH＝7）的溶解度约为49．0mg／L，在0．02mol／LHCL中，溶解度为118．0mg／L。纯Nisin的活性约为40×1000000IU／g（一般食品中的有效浓度为25～500IU／g）。而Nisin产品是Nisin与氯化钠等成分的复配品，其活性为1×1000000IU／g。

Nisin的活性在室温及酸性加热条件下均稳定。如Nisin在pH＝6．5的脱脂牛奶中，经85℃巴氏灭菌15min后活性仅损失15％，当Nisin溶于pH＝3的HCL中经121℃、15min高温灭菌仍能保持100％的活性，因此Nisin的耐酸、耐热性优良。

抑菌性

Nisin主要抑制大部分G＋菌的生长，包括产芽孢杆菌（如肉毒杆菌）、耐热腐败菌（如嗜热脂肪芽孢杆菌）等。它在食品防腐中的重要价值在于能抑制芽孢细菌（包括嗜热产气芽孢菌）。由于多数G＋菌能引起食品腐败，有些并能导致食物中毒等危害人健康，因此Nisin作为食品防腐剂是重要的、有效的。早期的研究认为，Nisin一般对霉菌、酵母菌和G－菌无效，但近期的研究表明，在一定条件下（如冷冻、加热、降低pH和EDTA处理），一些G－犤如沙门氏菌（Salmonellaspp．），大肠杆菌（Escherichiacoli），假单胞菌（Pseudomonsaspp．），拟杆菌（Bocteroidesspp），放线杆菌（Actinobocillusspp．）克雷伯氏菌（Klebsiellaspp）犦，对Nisin敏感。Nisin对微生物的作用机理有大量研究，Nisin对G＋营养细胞膜吸附，然后在细胞膜上形成空洞从而使胞内物质泄露，导致细胞解体死亡。所以确信与其他防腐剂不同，它是在孢子出现膨胀前就破坏其膜抑制了发芽过程。

安全性

Nisin是乳制品中所含天然产物，若干年来，它随着食品被人们摄入，并没发现毒性问题。现在已对Nisin的安全性问题进行了系统的研究，大鼠经口服LD50约为7000mg／kg体重，ADI为0～0．875mg／kg体重。研究表明，Nisin对蛋白水解酶（如胰蛋白酶等）特别敏感，因此食用后在消化道中即可很快被蛋水解酶水解成氨基酸。人在摄入10min后，在唾液中就检测不到Nisin的活性，故不会在体内残留，也不会改变肠道正常菌群，是一种安全的防腐剂。

Nisin的检测方法

最初测定Nisin的方法为1934年CoxG．A等人建议采用的甲基兰还原法，后来又发明了许多液体检测方法，如生长延迟法、比浊法、试管稀释法等，但因这些方法操作繁琐，结果不够准确而被逐步淘汰。后来又普遍采用平板琼脂扩散法，在培养基中加入吐温20或吐温80，可促进Nisin在琼脂中的扩散。目前在食品中常用的测定方法是使用试验菌滕黄微球菌的波带片抑制方法。另外，ELISA法即酶联免疫分析法能够检测出样品中极其微量的Nisin。

Nisin的发酵

Nisin广泛存在于天然牛奶及乳酪和酸奶中，鲜牛奶样品稀释后在含有检测菌及吐温20为扩散剂的固体检测培养基进行涂布，经30℃培养24h后，测量抑菌圈直径，挑取菌圈直径比较大的菌株是行平板划线分离，选取单个菌落接至试管斜面保存，然后逐一测定菌株的Nisin效价。可筛选出产Nisin的乳酸链球菌菌株。其发酵条件与乳酸链球菌株有关，综合看发酵培养基最适C源主要为蔗糖和可溶性淀粉，添加量随菌株的不同也有所不同；最适N源主要为酵母膏，添加量1％左右；最适P源为磷酸二氢钾，添加量一般≤5％。最适发酵条件为：温度30℃左右、pH为5．0～6．5。发酵液经萃取、沉淀、透析、离心、层析、干燥后可制得成品。

Nisin的应用

Nisin作为优良的天然防腐剂具有以下优点：（1）它是一种多肽，可以被人体内酶降解、消化；（2）对食品的色、香、味、口感不产生副作用；（3）它的使用可降低杀菌温度、减少热处理时间，因此可保持食品的营养价值、风味、结构、颜色等，同时可降低能耗；（4）它的酸性、热稳定性和低温贮藏稳定性，使其具有独特的使用特性。目前Nisin主要应用于以下几个方面。

乳制品

乳制品营养丰富，极易腐败变质，经巴氏杀菌和冷藏可延长保存期，但其中的肉毒梭状杆菌仍能存活，并产生一定毒素。Nisin可用于巴氏杀菌牛奶，添加量为30～50mg／kg，通常35℃下产品货架期可延长一倍。而20mg／kg的Nisin，完全抑制嗜热杆菌的生长。罐装炼乳中添加量80～100mg／kg的Nisin能减少10min灭菌时间。UHT奶中添加20mg／kg的Nisin能完全抑制灭菌乳中嗜热细胞菌芽孢的生长。在干酪加工过程中，Nisin的添加量从200～600mg／kg不等，这要取决于原材料的质量、产品配方，加工时融化滞留时间、储存期融化滞留时间等。在冷冻乳类甜点食品中添加50～100mg／kg的Nisin后，可延长货架期4～6倍。

肉制品　 Rayman等（1981）提出Nisin可作为腌肉制品生产中硝酸盐的替代物以避免或减弱它对人体的危害，如在烟熏火腿生产中，加入3000IU／mLNisin，在37℃存放56d不变质，硝酸盐含量同原来的150mg／kg降低到40mg／kg。Nisin可用于火腿、牛肉及鱼类、三明治等高蛋白食品，明显改变其质地外观，延长贮存期，并且可降低亚硝酸盐用量，减少对人体的危害。

罐装食品　 在酸性条件下，Nisin易溶、稳定、抑菌活性高，因而可用于酸性罐头食品的保鲜，使用100～200IU／mL能有效抑制嗜热菌的长生繁殖，降低杀菌强度，保证罐头的质量和风味。现已成功地应用于罐头食品的种类有萝卜酱、蘑菇、豌豆、番茄汤类等。

酒精饮料

OgdenK（1985）研究发明，Nisin对啤酒生产中常见的乳酸杆菌、啤酒片球菌有较强的抑制作用，使用浓度达到1000IU／mL时，即可抑制所有腐败菌，而对啤酒酵母无任何不利影响。OgdenK（1988）对照不加Nisin的啤酒，结果表明，加入10IU／mLNisin啤酒存放期延长了一倍的时间。由此可见，Nisin可用于啤酒、果酒、蒸馏酒精等乙醇饮料的酿造，以防止乳酸引起腐败。

酱菜

瓶装酱菜是可供长期贮存的方便食品，一般采用巴氏灭菌，残存的细菌主要为梭状芽孢菌及少数耐热的G－菌。传统的抑制杂菌的方法主要依赖于产品的高渗透压（高盐、高糖）、低氧环境及添加化学防腐剂。目前，各类酱菜中含盐量偏高，约为10％～20％之间，但高盐食品易诱发高血压等疾病，加入Nisin100mg／kg，可抑制杂菌生长，并使盐的浓度下降为7％～9％。

巧克力

Shehata等（1976）用少量Nisin作为佐剂来生产奶油巧克力，货架寿命大幅度延长，原来37℃只能保存3d～7d的产品，添加Nisin后能存放到21d，仍保持原风味。